Oko nas ima mnogo neopjevanih heroja, koji se čine običnim, ali u stvari nam tiho mnogo doprinose. Proteinaza K je "neopjevani heroj" u industriji molekularne dijagnostike, iako je u poređenju sa "velikim i moćnim" u industriji, proteinaza K toliko neupadljiva da smo dugo prevideli njen značaj. S izbijanjem nove epidemije koronavirusa, potražnja za proteinazom K je naglo porasla, a ponuda u zemlji i inostranstvu daleko zaostaje za potrošnjom, i svi su odjednom shvatili da je proteinaza K toliko važna.
Čemu služi proteinaza K?
Proteinaza K je serinska proteaza sa proteolitičkom enzimskom aktivnošću i može održavati aktivnost u širokom rasponu okruženja (pH (4-12,5), pufer s visokim sadržajem soli, visoka temperatura od 70°C, itd.). Osim toga, aktivnost proteinaze K ne inhibiraju SDS, urea, EDTA, gvanidin hidrohlorid, gvanidin izotiocijanat, itd., a određena količina deterdženta također može pojačati aktivnost proteinaze K. Proteinaza K se koristi u medicinskom tretmanu (dezinfekcija virusa i mikroba), hrani (omekšavanje mesa), koži (omekšavanje kose), vinarstvu (bistrenje alkohola), pripremi aminokiselina (degradirano perje), ekstrakciji nukleinskih kiselina, in situ hibridizaciji, itd. Postoje primjene proteinaze K. Najčešće korištena primjena je ekstrakcija nukleinskih kiselina.
Proteinaza K može enzimolizirati sve vrste proteina u uzorku, uključujući i one histone koji su čvrsto vezani za nukleinske kiseline, tako da se nukleinske kiseline mogu osloboditi iz uzorka i pustiti u ekstrakt, olakšavajući sljedeći korak ekstrakcije i prečišćavanja. U detekciji virusne nukleinske kiseline, proteinaza K je jedna od važnih komponenti u otopini za uzorkovanje virusa. Proteinaza K može razgraditi i inaktivirati protein omotača virusa, što je sigurnije tokom faze transporta i detekcije; osim toga, proteinaza K može i razgraditi RNazu, što sprječava razgradnju virusne RNK i olakšava detekciju nukleinske kiseline.
Preko noći slava proteinaze K
Bilo da se radi o polju naučnog istraživanja ili o polju dijagnostike in vitro, ekstrakcija nukleinskih kiselina je najosnovniji eksperiment, tako da je proteinaza K oduvijek bila veoma važna. Međutim, u prošlosti je proteinaza K bila mnogo manje poznata od svoje uloge. Veliki dio toga je bio zbog toga što je odnos ponude i potražnje proteinaze K bio veoma stabilan. Malo ko bi pomislio da bi snabdijevanje proteinazom K moglo biti problem.
S izbijanjem nove epidemije koronavirusa, potražnja za testiranjem nukleinskih kiselina je naglo porasla. Krajem juna 2020. godine, Kina je završila skoro 90 miliona novih testova na koronavirus, a ovaj broj je još alarmantniji na globalnom nivou. U eksperimentima ekstrakcije nukleinskih kiselina, radna koncentracija proteinaze K je oko 50-200 μg/mL. Općenito, potrebno je oko 100 μg proteinaze K za ekstrakciju uzorka nukleinske kiseline. U stvarnoj upotrebi, kako bi se povećala efikasnost ekstrakcije nukleinske kiseline, proteinaza K se često koristi u povećanim količinama. Detekcija nukleinskih kiselina novog koronavirusa dovela je do velike potražnje za proteinazom K. Prvobitna ravnoteža ponude i potražnje proteinaze K brzo je narušena, a proteinaza K je preko noći postala važan materijal za prevenciju epidemije.
Teškoće u proizvodnji proteinaze K
Iako su s razvojem epidemije ljudi cijenili važnu vrijednost proteinaze K, neugodno je što se zbog pretjerano niske popularnosti proteinaze K, malo domaćih kompanija bavilo proizvodnjom proteinaze K. Kada ljudi žele uspostaviti proizvodnju proteinaze K Tokom procesa proizvodnje otkriveno je da je proteinaza K izuzetno poseban protein. Izuzetno je izazovno proširiti proizvodni kapacitet proteinaze K u kratkom vremenskom periodu.
Proizvodnja proteinaze K u velikim količinama suočava se sa sljedećim poteškoćama
1. Niska ekspresija
Proteinaza K može nespecifično razgraditi većinu proteina i uzrokovati ozbiljnu toksičnost za ćeliju domaćina u kojoj se vrši ekspresija. Stoga je nivo ekspresije proteinaze K uglavnom vrlo nizak. Probir sistema ekspresije i sojeva koji visoko eksprimiraju proteinazu K uglavnom zahtijeva duži ciklus.
2. Ostaci pigmenata i nukleinskih kiselina
Fermentacija velikih razmjera uvodi veliku količinu pigmenta i ostataka nukleinskih kiselina domaćina. Teško je ukloniti ove nečistoće jednostavnim postupkom prečišćavanja, a složeno prečišćavanje povećava troškove i smanjuje stopu oporavka.
3. Nestabilnost
Proteinaza K nije dovoljno stabilna, može se sama enzimizirati i teško ju je stabilno čuvati na 37°C duži vremenski period bez zaštitnog sredstva.
4. Lako se taloži
Prilikom pripreme liofiliziranog praha proteinaze K, kako bi se osiguralo da je sadržaj čvrste materije proteinaze K u liofiliziranom prahu visok, potrebno je dodati liofilizirano zaštitno sredstvo u visokoj koncentraciji, ali kada koncentracija proteinaze K dostigne 20 mg/mL i više, lako dolazi do agregacije i formiranja taloga, što stvara velike poteškoće kod liofilizacije proteinaze K s visokim sadržajem čvrste materije.
5. Velika investicija
Proteinaza K ima snažnu proteaznu aktivnost i može hidrolizovati druge proteaze u laboratoriji. Stoga, proteinaza K zahtijeva specijalizirane proizvodne prostore, opremu i osoblje za istraživanje, razvoj i proizvodnju.
XD BIOCHEM-ov rastvor proteinaze K
XD BIOCHEM posjeduje zrelu platformu za ekspresiju i prečišćavanje proteina, te ima bogato iskustvo u ekspresiji i prečišćavanju rekombinantnih proteina i optimizaciji proizvodnih procesa. Brzim formiranjem istraživačko-razvojnog tima, prevaziđen je proces proizvodnje proteinaze K velikih razmjera. Mjesečna proizvodnja liofiliziranog praha je veća od 30 kg. Proizvod ima stabilne performanse, visoku specifičnu aktivnost enzima i ne sadrži ostatke citokroma domaćina i nukleinskih kiselina. Dobrodošli u kontakt s XD BIOCHEM. Nabavite probni paket (e-mail:sales@xdbiochem.comTel: +86 513 81163739).
Tehnička rješenja kompanije XD BIOCHEM uključuju
Korištenjem integracije višestrukih kopija plazmida, odabrani su sojevi s visokom ekspresijom i nivoom ekspresije od 8g/L, što prevazilazi problem niskog nivoa ekspresije proteinaze K.
Uspostavljanjem višestepenog procesa prečišćavanja, ostaci citohroma domaćina i nukleinskih kiselina proteinaze K uspješno su uklonjeni ispod standardne vrijednosti.
Kroz visokopropusno testiranje formulacija zaštitnih pufera, odabran je pufer koji može stabilno čuvati proteinazu K na 37°C.
Puferi za skrining prevazilaze problem lakog agregiranja i taloženja proteinaze K pri visokim koncentracijama, te postavljaju temelje za liofilizaciju proteinaze K s visokim sadržajem čvrstih tvari.
Uzorak XD BIOCHEM proteinaze K
XD BIOCHEM test stabilnosti proteinaze K: neće biti značajne promjene aktivnosti nakon 80 dana na sobnoj temperaturi
XD BIOCHEM test stabilnosti proteinaze K: neće biti značajne promjene aktivnosti nakon 80 dana na sobnoj temperaturi.
Poređenje efekta ekstrakcije nukleinskih kiselina pomoću XD BIOCHEM proteinaze K i konkurentskih proizvoda. U procesu ekstrakcije nukleinskih kiselina koriste se XD BIOCHEM i konkurentna proteinaza K, respektivno. Efikasnost ekstrakcije XD BIOCHEM proteinaze K je veća, a Ct vrijednost ciljnog gena je niža.
Vrijeme objave: 31. decembar 2021.