IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) je analog β-galaktozidaznog supstrata, koji je visoko inducibilan. Pod indukcijom IPTG-a, induktor može formirati kompleks sa represorskim proteinom, tako da se konformacija represorskog proteina mijenja, tako da se ne može kombinovati sa ciljnim genom, a ciljni gen se efikasno eksprimira. Dakle, kako treba odrediti koncentraciju IPTG-a tokom eksperimenta? Da li je što veća to bolja?
Prvo, hajde da shvatimo princip IPTG indukcije: Laktoza operon (element) E. coli sadrži tri strukturna gena, Z, Y i A, koji kodiraju β-galaktozidazu, permeazu i acetiltransferazu, respektivno. lacZ hidrolizira laktozu u glukozu i galaktozu, ili u alo-laktozu; lacY omogućava laktozi iz okoline da prođe kroz ćelijsku membranu i uđe u ćeliju; lacA prenosi acetilnu grupu sa acetil-CoA na β-galaktozid, što uključuje uklanjanje toksičnog efekta. Pored toga, postoji operativna sekvenca O, početna sekvenca P i regulatorni gen I. Genski kod I je represorski protein koji se može vezati za poziciju O operatorske sekvence, tako da se operon (meta) potisne i isključi. Postoji i mjesto vezivanja za mjesto vezivanja proteina kataboličkog aktivatora gena - CAP uzvodno od inicijacijske sekvence P. Sekvenca P, sekvenca O i mjesto vezivanja CAP zajedno čine regulatornu regiju lac operona. Kodirajući geni tri enzima regulirani su istom regulatornom regijom kako bi se postigla koordinirana ekspresija genskih produkata.
U odsustvu laktoze, lac operon (meta) je u stanju represije. U ovom trenutku, lac represor eksprimiran I sekvencom pod kontrolom PI promotorske sekvence veže se za O sekvencu, što sprječava vezivanje RNK polimeraze za P sekvencu i inhibira inicijaciju transkripcije; kada je prisutna laktoza, lac operon (meta) može biti indukovan. U ovom operonskom (meta) sistemu, pravi induktor nije sama laktoza. Laktoza ulazi u ćeliju i katalizira se β-galaktozidazom da bi se pretvorila u alolaktozu. Potonja, kao molekula induktora, veže se za represorski protein i mijenja konformaciju proteina, što dovodi do disocijacije represorskog proteina od O sekvence i transkripcije. Izopropiltiogalaktozid (IPTG) ima isti efekat kao i alolaktoza. To je vrlo snažan induktor, koji bakterije ne metaboliziraju i vrlo je stabilan, pa se široko koristi u laboratorijama.
Kako odrediti optimalnu koncentraciju IPTG-a? Uzmimo za primjer E. coli.
Genetski modificirani soj E. coli BL21 koji sadrži pozitivni rekombinantni pGEX (CGRP/msCT) inokuliran je u LB tekući medij koji sadrži 50μg·mL-1 Amp i kultiviran preko noći na 37°C. Gore navedena kultura inokulirana je u 10 boca od 50mL svježeg LB tekućeg medija koji sadrži 50μg·mL-1 Amp u omjeru 1:100 za ekspanzijsku kulturu, a kada je vrijednost OD600 bila 0,6~0,8, dodan je IPTG do konačne koncentracije. Koncentracije su 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1. Nakon indukcije na istoj temperaturi i u isto vrijeme, iz njega je uzet 1 mL bakterijskog rastvora, a bakterijske ćelije su sakupljene centrifugiranjem i podvrgnute SDS-PAGE kako bi se analizirao utjecaj različitih koncentracija IPTG-a na ekspresiju proteina, a zatim odabrala koncentracija IPTG-a s najvećom ekspresijom proteina.
Nakon eksperimenata, utvrdit će se da koncentracija IPTG-a nije što je moguće veća. To je zato što IPTG ima određenu toksičnost za bakterije. Prekoračenje koncentracije će također ubiti ćeliju; i općenito govoreći, nadamo se da što je više rastvorljivog proteina eksprimirano u ćeliji, to bolje, ali u mnogim slučajevima kada je koncentracija IPTG-a previsoka, formirat će se velika količina inkluzija. Tijelo, ali količina rastvorljivog proteina se smanjuje. Stoga, najprikladnija koncentracija IPTG-a često nije što veća to bolja, već što je koncentracija niža.
Svrha indukcije i kultivacije genetski modificiranih sojeva je povećanje prinosa ciljnog proteina i smanjenje troškova. Na ekspresiju ciljnog gena ne utječu samo faktori samog soja i ekspresijski plazmid, već i drugi vanjski uvjeti, kao što su koncentracija induktora, temperatura indukcije i vrijeme indukcije. Stoga je, općenito, prije nego što se nepoznati protein eksprimira i pročisti, najbolje proučiti vrijeme indukcije, temperaturu i koncentraciju IPTG-a kako bi se odabrali odgovarajući uvjeti i dobili najbolji eksperimentalni rezultati.
Vrijeme objave: 31. decembar 2021.