Ditiotreitol (DTT) je često korišteno redukcijsko sredstvo, poznato i kao novi zeleni aditiv. To je organski spoj male molekularne mase s dvije merkaptanske grupe (-SH). Zbog svojih redukcijskih svojstava i stabilnosti, DTT se široko koristi u biohemijskim i molekularno-biološkim eksperimentima.
Glavna uloga DTT-a je smanjenje disulfidnih veza u proteinima i drugim biomolekulama. Disulfidna veza je važan dio savijanja i stabilnosti proteina, ali pod određenim eksperimentalnim uslovima, kao što su reducibilna SDS-PAGE analiza, rekombinacija i savijanje proteina, potrebno je reducirati disulfidnu vezu na dvije tiolne grupe kako bi se razotkrila prostorna struktura proteina. DTT može reagovati sa disulfidnim vezama kako bi ih reducirao na merkaptanske grupe, čime se otvara prostorna struktura proteina i olakšava njegova analiza i manipulacija.
DTT se također može koristiti za zaštitu aktivnosti i stabilnosti enzima. U nekim reakcijama kataliziranim enzimima, aktivnost enzima može biti smanjena oksidansom. DTT može reagirati s oksidansima kako bi ih reducirao na bezopasne tvari, čime se štiti aktivnost i stabilnost enzima.
U poređenju sa tradicionalnim redukcionim sredstvima kao što je β-merkaptoetanol (β-ME), DTT se smatra sigurnijim i stabilnijim redukcionim sredstvom. Nije samo stabilan u vodenom rastvoru, već održava svoja redukciona svojstva i na visokim temperaturama i u kiselo-baznim uslovima.
Upotreba DTT-a je relativno jednostavna. Općenito, DTT se rastvara u odgovarajućem puferu, a zatim dodaje u eksperimentalni sistem. Optimalna koncentracija DTT-a mora se odrediti prema specifičnom eksperimentu i obično se koristi u rasponu od 0,1-1 mM. Niže koncentracije mogu smanjiti štetne efekte na rast ćelija i mogu smanjiti citotoksičnost zbog prekomjerne ekspresije ciljnih proteina. Veće koncentracije mogu uzrokovati prekomjerno metaboličko opterećenje ćelija, što utiče na rast ćelija i efikasnost ekspresije.
Optimalna koncentracija se može odrediti procjenom nivoa ekspresije ciljnog proteina provođenjem IPTG indukcijskih testova pri različitim koncentracijama. Testovi kulture malog obima mogu se provesti korištenjem niza IPTG koncentracija (npr. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, itd.), a efekat ekspresije pri različitim koncentracijama može se procijeniti detekcijom nivoa ekspresije ciljnog proteina (npr. Western blot ili detekcija fluorescencije). Prema eksperimentalnim rezultatima, koncentracija s najboljim efektom ekspresije odabrana je kao optimalna koncentracija.
Osim toga, možete se pozvati i na relevantnu literaturu ili iskustva drugih laboratorija kako biste razumjeli uobičajeno korišteni raspon koncentracija IPTG-a pod sličnim eksperimentalnim uvjetima, a zatim ga optimizirati i prilagoditi prema eksperimentalnim potrebama.
Važno je napomenuti da optimalna koncentracija može varirati ovisno o različitim ekspresijskim sistemima, ciljnim proteinima i eksperimentalnim uvjetima, tako da je najbolje optimizirati od slučaja do slučaja.
Ukratko, DTT je često korišteno redukcijsko sredstvo koje se može koristiti za smanjenje disulfidnih veza u proteinima i drugim biomolekulama te za zaštitu aktivnosti i stabilnosti enzima. Široko se koristi u eksperimentima biohemije i molekularne biologije.
Vrijeme objave: 28. septembar 2023.